ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种免疫测定方法，通常用于量化样品中特定目标的水平。常规用于 ELISAs 的样本包括血清、血浆、细胞培养上清液、细胞裂解液、唾液、组织裂解液和尿液。酶联免疫吸附试验通常在 96 孔微孔板中进行，微孔板上涂有对相关分析物的特异性捕获抗体。在与实验样品、标准品或对照品孵化时，目标分析物被该抗体捕获，一个共轭的检测抗体与目标分析物上的不同表位结合。随后加入底物溶液，产生一个与分析物结合量成比例的信号。



一、ELISA 的夹心法
夹心法是最常见的 ELISA 类型，它用两个特定的抗体被来夹住抗原，这通常被称为匹配抗体对。



捕获抗体被涂在微孔板上，加入样品，感兴趣的蛋白质结合并固定在板上。然后加入共轭检测抗体，与目标蛋白上的另一个表位结合。加入底物并产生一个与样品中存在的分析物数量成比例的信号。夹心法具有高度的特异性，因为需要两个抗体与感兴趣的蛋白质结合。

我们在确定生物样品中的分析物浓度时，往往会使用夹心法，这就是因为它具有最高的特异性和灵敏度，并且适用于复杂的样品基质，但需要注意的是，夹心法往往检测时间较长，而且开发难度要大于其他方法学。其中，双抗夹心法是最为常用的一种，分双抗体夹心和双抗原夹心。下面将以双抗体夹心法为例，和大家分享相关知识。

二、实验原理：
双抗体夹心法，其基本原理是将定量的包被抗体以物理吸附的方法固定于微孔板表面，然后加入待检标本，通过加入检测抗体，酶标记第二抗体后用 TMB 底物显色，微孔板中颜色的深浅与待测物的浓度呈正相关。



1、包被抗体
许多物质可作为固相载体，如聚氯乙 xi、聚苯 yi 烯、聚丙酰胺和纤维素等，在进行抗体固定化之前，需要对酶标板材进行筛选。酶标板由亲水到疏水，对蛋白的结合会由强变弱，造成吸附能力的差异。将抗体吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求 pH 在 9.0～9.6 之间。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：用不同的蛋白质浓度包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本 OD 值，选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。

2、标准品及样本
标准品即为目标物（样本中待检测因子）的纯蛋白，从母液稀释到级联稀释都需要特别留意，标曲的制作是 ELISA 实验成功的关键。待检目标物需具备多个抗原表位，即二价或二价以上的大分子抗原，因为这种检测方法需要两种抗体。另外，需要注意的是血清样本中的类风湿因子（RF）干扰——RF 能与多种动物的变性 IgG 的 Fc 部分结合而产生假阳性反应。

3、洗涤液
ELISA 操作中会涉及到多次洗板。长时间的孵育后，会出现非特异性结合，这时就需要洗涤液来洗去非特异性结合的蛋白或抗体，通常为 PBS，洗 4-6 次，每次 30s 左右。多次短时间洗板比少次长时间洗板更有效，在最后一次洗板时，尽量拍净液体，同时注意让板子保持湿润。

4、检测抗体
双抗体夹心法中的检测抗体与目标蛋白结合位点需要有别于目标物与包被抗体结合的位点，即会涉及抗体配对的问题。常用的抗体配对方法有下几种：
4.1 包被抗体为单抗，检测抗体为多抗；
4.2 包被抗体为单抗，检测抗体为单抗，但这两种单抗针对的抗原表位不同；
4.3 包被抗体为多抗，检测抗体为多抗，这两种多抗一般来源于不同的宿主。

5、生物素标记的二抗
鉴于酶标二抗的局限性，现在厂家一般引入生物素亲和素系统 (biotin avidin system, BAS)，这种系统在提高反应灵敏度的同时，应用起来也更加方便。进行生物素标记时，可依据抗体所带可标记基团种类（氨基、醛基、巯基等）以及分子酸碱性选择相应的活化生物素和反应条件。生物素标记后，不影响被标记物的生物活性。

6、辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素
每个亲和素分子可与 4 个生物素分子结合，所以可以偶合更多连接生物素的酶分子，从而大大提高了 ELISA 实验的灵敏度。生物素和亲和素间的亲和力强，二者一旦结合，就极为稳定，而且这种结合反应时间比抗原抗体反应所需时间短。在 BAS 检测中多用链霉亲和素「streptavidin, SA」，它是链霉菌培养过程中的分泌物，由 4 条相同的肽链组成。HRP 灵敏，稳定，比活性高，分子量小，纯酶容易制备。其有 4 对半胱氨酸形成的二硫键，99 位 Asp 和 123 位 Arg 形成的盐桥，9 个潜在的糖基化位点，有两个金属中心，可催化显色底物 TMB 产生蓝色一价物。

7、显色底物
由于 TMB（3,3',5,5'-四甲基联 ben 胺）比其他显色底物具有更高的灵敏度且无致癌性、故而被广泛使用。HRP 或其他适当过氧化物酶能在过氧化氢存在下催化 TMB 生成可溶的蓝色物，此时通常可在 370nm 测定吸光度。当显色反应被酸性溶液终止后，产物由蓝色一价物转为黄色二价物，此时可在 450nm 测定吸光度。

三、操作步骤
1、特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2、加待测标本：使之与固相抗原接触反应一段时间，让标本中的抗体与固相载体上的抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3、加酶标抗原：使固相免疫复合物上的抗体与酶标抗原结合。彻底洗涤未结合的酶标抗原。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量呈正向关系。
4、加底物：夹心复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗体的定性或定量。



四、注意事项
1、加样
要用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，不可出现气泡。
2、孵育
孵育的温度和时间应按规定的要求，保温容器最好是水浴箱。
3、洗涤
洗涤是决定反应成败的关键，不能忽略此步骤。
4、显色及终止反应
显色要按照规定的温度和时间操作，用酸终止。
5、结果判断
读结果时，要保证试验板是平整透明的，否则会影响比色结果。
 

五、ELISA 夹心法与其他 ELISA 方法相比的优点：

1、夹心法 ELISA 测试的灵敏度比标准的直接或间接 ELISA 测试高约 2-5 倍。

2、与直接法 ELISA 测试相比，夹心法 ELISA 试剂盒对目标抗原具有更高的特异性，因为需要使用两种抗体进行捕获和检测。

3、复杂成分样品可用于夹心法 ELISA，因为样品在测试前不需要纯化。

4、夹心法 ELISA 检测还允许更灵活的检测方法（可以使用直接或间接方法）。